蛍光用LEDの適応

ハイブリッドアプローチは、固体状態の光源が蛍光を照らすことを可能にする

Mar 23 2015
Henry Schek

他の用途と同様に、蛍光顕微鏡法は固体照明の魅力的な柔軟性を望んでいる。 しかし、ユビキタス複合顕微鏡に低コストの照明を適応することは技術革新が必要です。

生物医学的用途の中で幅広く多様な要求にもかかわらず、ユーザは従来の光源に対する固体状態の代替物に対する共通の要望を共有している。最も一般的なソリッドステート光源である発光ダイオード(LED)は、キセノン放電ランプのような従来の光源とは異なる光学特性を有するため、システム設計者にとって新たな制約を導入する。蛍光顕微鏡法は、固体光源の多くの利点を望んでいるが、特にLEDベースの光源では、蛍光励起のための最も制限された用途の1つである。この記事では、化合物を顕微鏡で蛍光イメージング用固体光源の利点と課題を探ります。

二つの支配的な要件

Mercury lamp, EGFP excitation, and Texas Red excitation spectra

1水銀スペクトルのピークは、フルオロフォアの人気を説明するテキサスレッドの励起とよく一致します。緑色蛍光タンパク質(GFP)の励起スペクトルは水銀スペクトルの弱い部分と重なるが、それにもかかわらず、GFPは生物学的実験におけるその利点のために普及している。蛍光のための理想的な光源は、可視光、近紫外光、遠赤色の間で調整可能な高出力を提供します。

蛍光顕微鏡のための光源の選択を促す2つの考慮点は、適切な蛍光色素励起のためのスペクトル要求、および複合顕微鏡設計によって課される光学的制約である。

もちろん、市場の魅力を広げるためには、重要な蛍光プローブをカバーする必要があります。しかし不可欠であるプローブ識別することは簡単ではありません。長年にわたり、蛍光顕微鏡検査は、伝統的に蛍光に対して最高の性能を提供した光源である水銀アーク灯のスペクトルピークに一致する一連の染料を開発した。一方、蛍光タンパク質は、市場がオフピーク(水銀アークランプのため)励起(図1参照)のような欠点を受け入れたことをそんなに新たな研究を可能にしました。現在、ソリッドステートシステムは、市場で成功するためには、両方のカテゴリーの染料に優れた性能を提供しなければなりません。したがって、広いスペクトル源が近UVから遠赤までのカバレッジを提供しなければならないと言うのは安全です。

化合物研究顕微鏡の光学的限界 - ほとんどの細胞生物学、分子生物学、および生理学研究室で見られるような - は、光源の設計に挑戦します。このような顕微鏡は、励起光で試料を照らすために対物レンズを使用する(したがって、エピ蛍光(epifluorescence)という用語)。その光は、開口絞りと視野絞りの両方を備えた照明経路、および光学フィルタを通過する。一般に、顕微鏡は、光源が試料平面で完全に焦点がずれており、対物レンズのバックアパーチャで焦点が合っているケーラー照明を提供するように設計されている。光は、画像を形成するために収束すると、半角を有する光線のみ<3.5°〜5°は、試料に到達し、それによって有用な励起を生成することができます。対物レンズのバックアパーチャが10mmよりもまれに大きいため、バックアパーチャでの光源の画像は、ほとんどの目的に適合するようにこのサイズにする必要があります。画像サイズとバックアパーチャにおけるビームの角度内容は、光源の設計を考えるにおいて中心的です。

スペクトルと光学ニーズを満たす

Cool white and warm white phosphor LED spectra

2典型的な白色広域スペクトルLEDは、実際には、青色光の一部が変換され、一部は変換されずに通過することを可能にする蛍光体コーティングを有する青色LEDである。これにより、450nmを中心とする青色LEDピークと、500〜> 700nmにわたるより広い蛍光体ピークとからなる白色に見えるスペクトルが得られる。そのようなLEDは、その範囲のほとんどにわたって蛍光を励起するのに有効であり得る。しかしながら、近UV /紫色の欠如、限られた電力/面積、及び高度に発散発光は、その用途を制限します。

蛍光励起のためのLEDの適合性は、最も一般的なフルオロフォアの励起帯域における光の量(ミリワットまたはワット)に依存する。これらの測定値はほとんどのアプリケーションにとって重要なので、しばしば、ソリッドステートソースは、ルーメン、カラーレンダリングインデックス、または色温度の観点から定義されます。残念なことに、これらの仕様はスペクトルを単一の数値に崩壊させ、人間の色知覚を説明します。これにより、光源設計者は、候補LEDの潜在的な価値を判断するために、実際のスペクトル内容と放射電力を分析する必要があります。しばしば、サンプルのテストは最も効率的なアプローチです。

単一のLEDは、広域スペクトル、多目的蛍光励起のために必要な全範囲をカバーすることができません。実際、LEDチップ技術は540〜590nmの範囲でほとんど何も提供していません。他の用途では、これは、2に示すようなスペクトルを作成するために、蛍光体と一緒に青色LEDを使用することによって解決されます。これらの「白」LEDが蛍光のために働くことができますが、それらはスペクトルの重要な部分が欠けているので、その出力は、他のLEDのそれと組み合わせる必要があります。このアプローチは市場で利用可能で、一般に4〜7個のエミッタを使用します。それでも、サンプルに利用可能な総電力は、LEDの電力密度によって制限されます。

水銀ランプの歴史的な使用は、典型的には0.5〜2.5 ム・ロングアークの画分を使用して、ほぼ点光源である照明源で動作するように設計された光学系をもたらしました。メタルハライドランプが普及するにつれて、液体光ガイド(LLG)用のアダプター光学系は、既存の顕微鏡で可能な限り最善の動作をするように最適化されました。 これらのケースでは、LLGの端部は、3mmの直径分散源と同様に作用します。LED光源は同様の分布源であり、しばしばあらゆる角度に光を放射する。

FIG 3. The ability of an optical system to create an arbitrarily small focus is limited by the size of the source and divergence of the emission.

図3:任意の小さな焦点を生成する光学系の能力は、光源のサイズおよび排出の発散によって制限される。a)は、基本的な光学的不変量の図である。蛍光照明光学系によって受け入れられたLED排出は、対物レンズの後方焦点面においてより大きな画像を生成するように拡大される。その結果、避けられない結果として像への収束角が減少する。b)は、表面エミッタからの光の角度受容を制限するシステムの結果を示す。半球全体の表面積は、LEDの完全な排出に対応するが、より小さな円錐によって囲まれた領域は、10°の受け入れ半角を有するシステムに利用可能な光に対応する。

図3aは、エミッタのサイズ及び発散光が対物レンズを介して励起のために使用することができる程度との間のトレードオフを検討する1つの方法を示しています。標準複合顕微鏡上の対物レンズ(製造業者に依存する)は、3.5°〜5°の半角の蛍光照明光を受け入れることができる。この半分の角を超えた光は、対物を通過しません。 そうであれば、光はバックグラウンド蛍光を増加させ、コントラストを低下させる可能性がある。ビームのサイズは対物のバックアパーチャによって制限されますが、10mmを超えることはめったにありません。対物(平面2)のバックフォーカルプレーンと光源(平面1)で光学不変量(式1を参照)を取ると、空気中の一般式は次のようになります。

BioOptics World: Equation 1

エミッタ用に4.25 mmの円形LEDを考え、式1を適用してq1を計算します。

BioOptics World: Application of equation 1 to calculate q1

したがって、複合顕微鏡の2つのパラメータ、照明の3.5°~5°半角および直径10mmのアパーチャは、光源から12°未満に発散する使用可能な光を制限する。光学系が、25°未満の角度で発散するLEDからの光線を集めるように設計されている場合、同じアプローチでは、d1 = 2mmのLEDが推奨される。それ以上のものは、無駄な電力と余分な熱を管理する必要があります。

光学的不変アプローチは、トレードオフを強調する効率的な方法であるが、 3bは、計算効率がより複雑でなければならないことを示している。スループットまたは総電力は、ビーム全体にわたって統合されなければならない。 これには、エミッタとソリッドアングルの有効領域、または実際のパワー値に正比例する量の使用が含まれます。(詳細な例は、R. John Koshel著、「照明エンジニアリング:非イメージング光学を用いた設計」、Wiley-IEEE Press [2013]を参照)。

この記事の範囲を超えて議論を避けるために、我々は単純化されたアプローチを取ります。2は、時にはスループット、エタンデュー、又はエリア角製品と呼ばれる関係を示しています:

BioOptics World: Equation 2

ここで、Aは光源の面積であり、使用可能な光線を含む立体角である。LEDの全排出に対する排出の使用可能な部分の比率は、ロスレスシステムの場合に可能な最大効率を与える。この場合、重要な比較は、LEDまたは他の光源の全出力と顕微鏡の出力との間にあり、単純な比(式3)につながる:

BioOptics World: Equation 3

12°の使用可能な半角および全半球排出(θtotal= 90°)を備えた4.25mm LEDに戻って、残りのシステムが完全であれば最大効率は約4%になります。この例では、当然のことながら、ばかばかしいですが、それはスループット分析の重要性を示しています。25°の角度を持つ2mmのLEDは18%の効率をもたらし、LEDの本質的な明るさで十分であれば動作させることができます。60°の使用可能な半角を持つ1mmの直径のLEDは、75%の最大効率で最良のバランスである可能性があります。これは、予想されるように4倍の発光領域と、LEDの約4倍の効率です。

二つの主要な制約の影響は、蛍光励起用の広域スペクトル源を構築するための明確です。第1に、顕微鏡のエタンデュの限界は、表面発光体の使用可能なサイズを約1mm 2に制限し、使用可能な発光を50〜60°に制限する。第2に、蛍光用の広域スペクトルLED光源は、蛍光体の使用を必要とする領域を含む、近UVから遠赤までの光を必要とする。第3に、蛍光体を使用するほとんどの白色LEDは、近紫色および近紫外領域において十分なスペクトル内容を有していない。 単一のLEDで必要な光のすべてを供給することはできません。

ソリッドステートの代替

OSRAM's ITOS PHASER 3000 can produce substantially more power; when paired with 89 North's SAM, it allows for the addition of needed wavelenths

図4:OSRAMのITOS PHASER 3000は、22°の出力に含まれる白色LEDと本質的に同様のスペクトルで、実質的により多くの出力を生成することができます。白色LEDと同じように、しかし、いくつかのアプリケーションは、追加のスペクトル成分を必要としています。89 Northによるスペクトル加算モジュール(SAM)を備えたPHASERは、必要な波長の追加を可能にする。SAMは、PHASERの出力光学系に直接適応し、Chroma Technologyと共同開発した独自の光学構成を採用しています。SAM出力は、基本的なPHASERと同じファイバまたは液体ライトガイドを受け入れます。(a)はスタンドアロンPHASER(黒線)のスペクトルは、SAMで増強することができる5つのスペクトル領域と比較されますb)蛍光励起に使用可能なものを含むPHASER出力がc)に示されている。

ヘッドライトへの家庭からのアプリケーションのLEDのユビキタス性は、他のソリッド・ステート・オプションが存在することを忘れすることが容易になります。 スーパールミネッセントダイオードとソリッドステートレーザー技術は、低コストのレーザーダイオードから高性能のダイオードポンプレーザーまで、あらゆるものに対応します。レーザーダイオード単独では、組み合わせても連続した広いスペクトルを生成することはできません。 また、スーパールミネッセントダイオードは、いくつかの理由のために実用的ではありません。これは、蛍光顕微鏡検査のニーズを満たすハイブリッドアプローチの可能性を残す。

1つのアプローチは、LEDによって達成されるよりもはるかに高い強度で蛍光体を照射することを含む。これには、許容可能なコストでレーザ状の出力を有する明るい、固体状態の光源が必要である。レーザーダイオードは、これらの基準を満たす。実際には、複数のレーザダイオードは、入射強度の桁違いの増加および放電ランプのアークにサイズが類似近点光源を生成するために、蛍光体の小さなパッチに重畳することができます。

戦略は、高度に集束された電力を扱うことができる(バインダー材料を含む)の蛍光体を必要とし、それは、熱を管理するために適切な熱戦略を有しています。OSRAMのITOS PHASER 3000(図4a参照)はそのような供給源の一例です。これは、青色レーザダイオードのバンクを使用して蛍光体を励起し、LEDチップによって生成することができない緑がかった黄色の光を生成する。PHASERは、蛍光灯の励起にのみ内部でレーザーダイオード光を使用し、Class Iレーザー製品(レーザープリンターを含むクラスなど)と同等のものにします。したがって、通常動作のためのレーザーの安全対策を必要としません。必要な白色スペクトルを達成するために、青色LEDは、より低い波長成分を加える。このLEDは単なる青色発光体であるため、蛍光体はそのパワーを他の波長に変換する必要はない。一緒になって、スペクトルは、測光用語では300Wキセノンランプに匹敵するが、白色LEDのスペクトル(図4b参照)に匹敵する光を生成する。

適切な光学系を有するITOS位相器システムは、430 nm以下の波長のみを欠く、蛍光顕微鏡に使用される可視域のほとんどを提供しています。大型システムにサブシステムとして組み込むために設計されており、他のコンポーネントへの電力、冷却、光学マッチングを提供します。パートナー会社89 NorthおよびChroma Technologyは、個々のLEDまたはレーザーダイオードで余分な波長をSpectral Addition Module(SAM;4a参照)で追加することを可能にしました。 このモジュールは、効果的にPHASERのスペクトルを拡大します(図4b参照)。PHASERはほとんどのパワーとスペクトラムを提供し、SAMはアプリケーションクリティカルな波長を追加します。

ITOS PHASER 3000の出力は、22°の半角発散のφ5mmのアパーチャです。全領域を使用し、方程式2を適用して出力から発散する使用可能な角度を計算すると、使用可能な半角の〜10°が得られます。 これは22%の最大効率を意味する。PHASERは4.25 mmの直径、蛍光体コーティングされたLEDと同様の電力を生成するが、より狭い出力します。 これは、顕微鏡(図4C参照)を介して、はるかに良好な結合をもたらします。1mmの白色LED(PHASERと比較して蛍光照明の効率が約3倍である)でさえ、全光量の10〜15%しか生成しない。最適なLEDと比較して、PHASERは蛍光励起に2〜4倍の光を供給します。 したがって、複合アプローチの可能性を実証します。

さらに良い

化合物な顕微鏡の幅広く連続したスペクトルと厳しいスループット限界の要求は、LEDを顕微鏡検査に適応させることを挑戦しました。しかし、技術が進歩するにつれて、拡張されたソースの出力を管理する上でデザイナーはより良くなってきました。多くの優れた製品が好評を得ており、さらに明るさと範囲の要求がありました。

ITOS PHASER 3000は、ソリッドステートソースから白色スペクトラムを生成するという一般的な問題に珍しいアプローチをとります。狭いビームで保持されている強力な出力は、蛍光顕微鏡検査の大きな可能性を提供します。総電力、5mmアパーチャ、22°フルアウトプットは、蛍光内視鏡検査、蛍光誘導手術、全動物インビボイメージングなどの他の軽量アプリケーションにも役立ちます。

備考:

開発者89 Northは、2015年8月にOEM統合のためにSAMをリリースし、2015年後半にはこれらの技術に基づく完全な光源を導入する予定です。

HENRY SCHEK はバーモント州バーリントンの89 Northのエンジニアリングディレクター兼ディレクターです。 www.89north.com

Article Gallery

An indirect immunofluorescence image of cells in interphase and mitosis. Presplicing factors are stained red and chromatin stained blue. (Image courtesy of Steve Mabon and Tom Misteli, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD)FIG 1. The peaks of the mercury spectrum align well with the excitation of Texas Red, which accounts for the fluorophore&#039;s popularity.FIG 2. The typical white broad-spectrum LED is actually a blue LED with phosphor coating that allows some of the blue light to be converted and some to pass through unconverted.FIG 3. The ability of an optical system to create an arbitrarily small focus is limited by the size of the source and divergence of the emission. FIG 4. OSRAM&#039;s ITOS PHASER 3000 can produce substantially more power with a spectrum essentially similar to that of a white LED, contained in a 22° output.

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