ライフサイエンス顕微鏡検査のクローズアップビュー

イメージングの速度と解像度の限界を押し進める

Dec 1 2012
Vicki Glaser

科学のあらゆる分野において、新しい発見はしばしば基本的な質問に対する答えを見つけることに依存する。新しい医薬品の薬物を研究するときには、しばしば健康な細胞と病気の細胞と組織の違いを明らかにし、分子レベルで細胞機能と機能不全の生物学的基礎を理解することを意味します。

顕微鏡および画像技術は、コンピュータおよびソフトウェアアプリケーション、検出器、光源、および標識および検出システムの進歩と同期して進化してきた。顕微鏡は、正確に何が分子レベルで起こっているかを照らすことを目指した研究においてますます重要な役割を果たしています。 例えば、ウイルスが宿主細胞に感染すると、リガンドが膜受容体に結合するか、または腫瘍細胞が転移する。

高度なイメージング技術を特集した出版物の豊富さと、イメージングセンターの設立と拡大を支援する助成金賞は、生物医学研究における顕微鏡技術の重要な役割の証拠です。

例えば、ユタ大学のHIVセンターは最近、NIHから2180万ドルの助成金を受けました。 センターは、この資金を使用して、AIDSを引き起こすウイルスの構造生物学を画像化および研究し、それが宿主細胞、複製物、および広がりにどのように感染するかを理解する方法を開発する。

セントルイスのWashington University School of Medicineの分子イメージングセンターは、NCIから710万ドルの助成金を受けました。そして、Dana-Farber癌研究所は、マサチューセッツ生命科学センターから$ 10百万補助金を受けました。 Dana-Farberはこのファンドを使用して、癌イメージング研究プログラムを拡大し、新しい分子イメージングプローブの開発を目的とした研究イニシアチブである分子癌イメージング施設の設立を支援します。

これらの大きな助成金は、イメージング技術の高コスト化を強調しており、顕微鏡システムの開発者が表現する最も重要な目標の1つは、所有コストを削減し、技術のアクセシビリティを拡大することです。

最も高度な技術は、世界のトップ生物学者に利用可能です。 GEヘルスケアのアプライドプレシジョンの科学ディレクターであるPaul Goodwin氏は、「生物学者すべてにとってより経済的かつ技術的にアクセス可能にする必要がある」と述べている。」

顕微鏡検査の業界を調査すると、いくつかの重要な傾向が浮かび上がっており、最も顕著なのは解像度の向上と、生きた細胞や生物における超解像技術と動的イメージングの出現です。

新興の超解像方法は、様々な洗練された技術を表しています。 これらは、構造化照明顕微鏡(SIM)、確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、空間変調照明(SMI)、基底状態枯渇(GSD)および誘導放出枯渇(STED)を含む。

生存細胞/生物イメージングは、起こっているときに生物学的プロセスおよび生理学的プロセスを捕捉するために、より高速な画像取得を必要とする。 例えば、タンパク質 - タンパク質相互作用、細胞移動、細胞分裂またはアポトーシス形態学的変化、およびイオンチャネル活性などの場合。ライブセルイメージングへの関心の高まりは、関連分野の発展に拍車をかけています。 例えば、生物学に影響を及ぼしやすく、細胞の生存能力を損なう可能性のある大量の光に曝される必要がない、侵入性が低く破壊的な方法を可能にするラベルフリーイメージング。

追加の傾向は、定量化、共局在化、相関顕微鏡法、および統一された多機能システムにおける異なる顕微鏡法の統合に重点を置いている。深部組織イメージングと3D顕微鏡法の進歩は、多細胞および組織構築物を検査するために単層培養された細胞を研究する代わりに、より自然でダイナミックな環境で生物学を探索する傾向を反映する。

課題は、主に、光を吸収して散乱させる組織の能力、および組織を結像する際の信号対雑音比の低下に寄与する他の要因、ならびに分解能を損なう可能性があることである。

解像度の解決策

Goodwinは、バイオファーマの研究開発分野でさまざまな技術的およびアプリケーション指向のニーズを満たすために、比較的短時間に複数の新技術が登場する「顕微鏡検査におけるルネッサンス」について述べています。

基本に戻ると、「顕微鏡のガラスレンズは100年で大きく変化していません」と彼は説明します。顕微鏡システムにおける主な進歩は、洗練された計算技術とセンサ技術の組み合わせであった。これは、超解像イメージング技術、ラベルフリーイメージング、相関、定量、3D顕微鏡の進歩など、この記事で強調している主な傾向のいくつかに明らかです。

超解像イメージングの進歩により、同じサンプルとライブセルイメージングで空間的および時間的解像度が可能になると、Goodwinは述べています。例えば、彼は、1ミクロン未満のスライスを1秒未満で撮像し、ワイドフィールドイメージングを> 400fpsで行うことができる、同社のDeltaVisionOMX®超解像システム/ BLAZE™3D SIMモジュールを紹介します。

Goodwinは、Straussらによって最近発表された論文に注意を引きます。 (PLoS Biol)は、3D-SIM超解像顕微鏡法を用いて、細菌の細胞分裂の経時的イメージング研究を行い、タンパク質動態および細胞質分裂に寄与するタンパク質分布の変化を視覚化することを記載した。

超解像技術を選択することは、より高い解像度と動的イメージングとの間のトレードオフを意味すると、ライカマイクロシステムズのライフサイエンス研究のマーケティングマネージャー、Chris Vega博士は説明する。たとえば、STEDを使用すると、「純粋に光学的な方法で画像を作成することができます」、通常は40〜50 nmの範囲で解像度を達成します。個々の蛍光体の局在化を伴うGSD法有する一方、20nm程度の高い解像度は、既存の技術を用いて実現可能です。 しかしながら、GSDは、生きたサンプルよりも固定されたサンプルで良好に機能する。

ライカの超解像度システムへの最新の追加は、10月のSociety for Neuroscienceミーティングで発表した第3世代のTCS SP8 STED機器です。これは、ゲートされたSTEDのオプションが含まれています。 これは、解像度とコントラストを高めるために、ライカのHYDの™ハイブリッド検出技術と白色光レーザーを組み合わせたものです。

顕微鏡業界は、超解像に向かっていますか?細胞生物学者と分子生物学者は、価値のある情報を得るために超解像度を越える必要がありますか?必然的に、そこに今までより高い分解能を達成するために努力しています研究コミュニティ内のグループになり、他の人は、それ用のアプリケーションを検索します。

現在、グッドウィン(Goodwin)が観察しているように、解像限界は、主に緑色蛍光タンパク質および標識抗体などの自己蛍光タンパク質のサイズに依存する。システムは、約15〜20 nmの範囲に取り掛かることができます - 関心の標的タンパク質に関連付けられている標識された抗体のほぼ同じサイズ。「私たちは個々の分子の解像度を取得すると思います、」Goodwinは予測しています。

「私は誰かが[単一]ナノメートルまたはピコメートルの解像度で作業していることを保証し、」Brian Manning博士、Chromaでのアプリケーションの科学者が追加されます。

顕微鏡開発者やエンドユーザ用の光学フィルタとミラーの製造業者として、Chromaはアプリケーションの傾向に関連する変化する要求に対応しています。例えば、生きている動物の研究中に個々のニューロンのイメージングを可能にするために、ニューロンへのロドプシンタンパク質の導入と組み合わせたオプトジェネティックスへの多くの関心が引き続き存在する。

これらのタイプの実験は、ニューロンネットワークをマッピングし、シグナル伝達経路をマッピングする努力の一部である。彼はまた、ますます平坦なダイクロイックミラーの顧客からの需要についても述べています。 具体的には、ミラーの平坦性は、ビームの変形を最小化することができるの制限要因である全内部反射蛍光顕微鏡の用途に使用するため。

自業自得

「古いものはもう一度新しいものになる」マニングは言う。 彼は、技術開発の基本的な基盤には、以前に来たものの「絶え間ない再訪」が含まれているという概念を説明しています。良い例は、ラマン顕微鏡法の復活であり、具体的には、イメージングが分子の振動サインに基づくCARS(コヒーレントアンチストークスラマン散乱)と一般に呼ばれる技術である。このラベルフリーの方法は、フルオロフォアの必要性を排除します。

ラベルフリーイメージング技術は、ますます神経のアーキテクチャを研究し、このような神経変性疾患に関与しているニューロンの髄鞘形成とremylelinationなどのプロセスを理解するために使用されています。

オリンパスアメリカの科学機器グループのシニアプロダクトマネージャであるBrendan Brinkmanによれば、CARSなどの技術を使用して、研究者は「ミエリンを本質的にイメージングする」ことができます。 これにより、CARSは、例えば、アテローム性動脈硬化症におけるプラーク形成の研究、または肥満を標的とした薬物の開発において有用なツールとなる。

オリンパスは、タンパク質自己蛍光を検出するためにCARSと二光子顕微鏡法を使用して、共局在ラベルフリーイメージングを組み合わせたマルチモーダル光学イメージングアプローチを採用しています。 この技術はまた、例えば、健康な動脈壁、早期のアテローム性動脈硬化病変、および進行したアテローム硬化性プラークを区別する能力を実証している。

「昨年、我々は細胞を損傷させることなく細胞を容易に画像化するマーカー技術の進歩を見てきました」と、オリンパスの中核顕微鏡検査研究担当マーケティングマネージャー、Paul Jantzen氏は言います。 「これらの技術には、プロメガの小型で軽いルシフェラーゼ酵素が含まれます。

マーカーはより明るく、蛍光は含まれないので、細胞は高強度の光に曝されず、画像化はより長い時間にわたって伸長することができる。オリンパスは、ルシフェラーゼベースの細胞イメージングをサポートするために、今年の末までに米国市場にそのLuminoview LV200発光顕微鏡を導入する予定です。

2光子共焦点顕微鏡法または従来の顕微鏡法を用いて組織切片全体でラベルフリーの画像化を行う能力は、清澄剤の開発によって促進されてきた。 これらは、光が3D構造を視覚化するために組織サンプルのより深くに浸透することを可能にする。

「今、光学顕微鏡の解像度で2光子顕微鏡法を行い、無傷の組織を見るために8mmまで下げることができます」とBrinkmanは述べています。同社のScaleview-A2クリアリングソリューションとScaleview浸漬対物レンズは、FV1200MPEシステムで高分解能で大きな組織領域のイメージングを容易にするように設計されています。

研究者は、固定された組織の広い領域をxとyの次元でイメージすることができるだけでなく、z次元もイメージングすることができます。「全体のスライドイメージングが本当に最前線に来たのです」とJantzenは言います。「彼らはそれをより速く行うことができ、生成された大量のデータをより適切に管理することができます。」

多細胞構築物および組織を画像化するために、二光子顕微鏡法は、細胞と相互作用しにくく、散乱される可能性の低いより長い波長の使用を可能にする。 これは、より深い光浸透およびより良好なZ分解能をもたらします。QImagingのアプリケーション科学者James Joubertによると、これらのタイプのアプリケーションは、遠赤外線または近赤外光子によって励起されるか、または赤外光子を放出する蛍光体のより多くの使用につながっています。

定量とデータオーバーロード

グッドウィン氏は、定量的位相顕微鏡法などのラベルフリー技術をしっかりと信じていると言います。彼は、この「新進気鋭の技術」は蛍光標識技術よりもはるかに少ない光を必要とし、生細胞ダイナミクスの非侵襲的な監視を可能にすると主張している。

定量化は、一般に、顕微鏡検査における鍵となる傾向であり、プロテオミクスデータを捕捉する能力を増大させる。

アッセイ、照明源、蛍光色素、および検出器の改良を含む、イメージングにおける定量化の新たな傾向には、複数の要因が寄与している。定量的な出力は、組織内および異なる地理的地域内の研究所、研究グループ、および共同研究者の間の結果の比較を可能にする。また、顕微鏡やイメージングシステムを持たない人々は、画像を見て情報を得ることができます。

定量化を進める上での主な課題は、Lumencorの顕微鏡部門の北米セールスマネージャー、T. Regan Baird博士によると、標準化の必要性です。計測器およびソフトウェアの開発者およびユーザーは、この新技術を既存の標準に適合させるかどうか、どのようにして規格を修正するか、フォーマットを決める必要があります。

一例として、博士ベアードは、データベース化のための標準フォーマットが存在しないいる新しい科学CMOS(sCMOS [相補型金属酸化膜半導体】)イメージング技術を用いて収集されたデータの広大な量を指します。

新しいsCMOS技術の例として、浜松のORCA-Flash4.0とGEN II sCMOS検出器があります。

Carl Zeissのバイオサイエンス製品マーケティング担当ディレクター、Duncan McMillanは、主要な課題のいくつかを克服するのに役立つ、大きな組織サンプルや生きた細胞や生物をイメージングするためのいくつかの新しい技術と技術を指し。

例えば、「スマート顕微鏡法」アプローチでは、サンプルを十分な解像度で撮像して、どこに戻る必要があるかを判断し、より高い解像度でサンプルを視覚化して、求めている情報を得る。この「初回通過」アプローチは、データの過負荷の問題を回避し、最も重要で関連性の高いデータの取得に集中し、結果の時間を短縮することを目的としています。

最近のNeuroscienceミーティングで、ZeissはLightsheet Z.1 LSFMイメージングシステムを発表しました。このシステムは、光毒性の低い数時間から数日にわたる大きな生体試料の3D蛍光イメージング用に設計されています「光シート」は、試料の薄切片を照明する拡大された光画像はライトシートに対して90°の角度でキャプチャされ、異なる視野角から撮影された画像を計算して3D再構成およびタイムラプスビデオに組み合わせることができます。

Zeissの新製品はSigma VP 3View走査電子顕微鏡です。 これは、ナノメートルの解像度で3D画像を生成するために、組織の固定されたブロックからの連続サンプルの数千の連続切削やイメージングを可能にするために、SEMチャンバ内ウルトラミクロトームを組み込みます。

McMillanはまた、このタイプのアプローチを容易にし、研究者を助ける相関顕微鏡法を指摘する。例えば、光学顕微鏡を用いて生脳細胞のサンプルが撮像されます。 サンプルは、組織の収縮または歪みなどの要因を考慮しながら、同じ部位に画像を定位させる能力を有する電子顕微鏡で画像化するために固定され、ラベル付けされる。

Brinkmanは、ランダムアクセス顕微鏡の使用の増加を記述している。 サンプル全体をスキャンするのではなく、サンプル内の位置を移動し、蛍光強度の変動を測定する方法です。関心の位置のみを標的とすることにより、データ収集は、このような脳の神経解剖学などの生体組織における生理的な測定に関連するスピードを有効にする、高速です。

イメージングの速度を上げると動的生細胞イメージングを実行するためにドライブは、データおよびデータ記憶容量の量を捕捉し、転送する検出器の能力によって制限されます。

“「あなたがコンピュータに検出器からの画像データを転送し、それを格納する必要があり、」博士Baird氏は述べています。1つの画像で少なくとも半分のメガバイトのデータが得られ、1回の実験で数千の画像が収集されます。

別の進歩の数は、新しい光源技術を含む、増加した撮像速度に貢献しています。 蛍光体を保存しながら多色画像取得を提供する検出器と同期することによって迅速な波長変化を可能にする光エンジン; 光毒性の減少; 信号対雑音比を増加させます。

Lumencorの新しいSPECTRA X light engine™は、可視スペクトル内でシングルバンドパスフィルタを備えた最大6つの光源を含むハイブリッドソリッドステートライトエンジンです。これにより、ユーザーは、彼らが多色蛍光顕微鏡のために生成したい光の特定の波長のみを選択することができます。将来的には、Lumencorの博士Bairdは、このような蛍光および電子顕微鏡の機能を組み合わせてしまう楽器などマルチモーダルプラットフォーム上の技術のより多くのマージを想定しています。

3つの基本的な柱

今後の主な動向は、ニコン・インスツルメンツの上級顧問であるStanley Schwartz氏が述べた「顕微鏡検査の基本的な3つの柱」の継続的な改善に焦点を当てる」スピード、感度、解像度である。」

これには、光学系のスペクトル特性を改善して、より高い伝送速度でより広いスペクトル範囲を達成し、球面収差および色収差を改善または補正することが含まれる。Schwartz氏は、研究顕微鏡および細胞生物学のための最大の市場セグメントとしてライブセルイメージングを識別します。

「約10nm分解能は、細胞イメージングに最適なサイズスケールです」とニコンの製品マーケティング部門のゼネラルマネージャであるスティーブ・ロス(Steve Ross)は言います。これにより、研究者は個々のタンパク質の分解能に到達することができます。「今、我々は、動的なイメージングを行うことができる、すなわちある期間にわたってその解像度のレベルで生きた細胞をイメージングすることができることを望んでいる。」

生細胞イメージングを対象とした製品の1つはNikonのPerfect Focus Systemです。 このシステムは、生細胞の長期間のタイムラプスイメージングを強化し、ドリフトを補償することによって焦点を合わせたままにする能力を提供するように設計されています。それは、近赤外870ナノメートルLEDおよびCCDラインセンサーを組み込み、5ミリ秒(200Hz)のサンプリングレートを提供し、媒体への薬物灌流によって引き起こされるような、焦点の急激な変化に敏感でないようにする。

「超解像顕微鏡法は市場に大きな影響を与えており、相関顕微鏡法で作業することができます」とRoss氏は言います。彼はそれが電子顕微鏡法では達成されない特異性で分子レベルでイメージングを可能にすると付け加えている。ユーザがこの新しいデータを、他の顕微鏡技術を用いて生成された他の画像化結果と相関させるのに役立つソフトウェアが利用可能になっている。

SchwartzとRossは、幹細胞研究と幹細胞技術の医療応用の分野において、引き続き強力な成長を見込んでいます。幹細胞の増殖と研究には特別な課題があります。このようニコンのBiostationsなどの技術は成長、生存率、または刺激に応答の変化を測定するために、自分の環境からそれらを削除せずに幹細胞培養物のモニタリングを可能にします。 これの2つの例は、温度、湿度、二酸化炭素の制御条件下で培養された細胞の時間経過イメージングを可能にするインキュベーションおよび顕微鏡システムが含まれているニコンのBiostation CTおよびIM顕微鏡システムです。

生細胞ダイナミックイメージングには、十分な空間的および時間的分解能を有するレセプター結合およびイオンフラックスなどの高速事象を捕捉する能力が必要である。既存の技術は、10〜15フレーム/秒で画像化の必要性を満たすことができますが、数十ミリ秒の時間スケールで発生するイオンのシグナル伝達などのイベントは、フレーム/秒の100Sで高分解能イメージングが必要です。

QImagingの製品開発科学者、クリス・ライアン(Chris Ryan)は、「そのニーズは十分に満たされていません。sCMOS技術は、高速と低ノイズと解像度の組み合わせの課題を克服する可能性を秘めているが、それは現時点では高価な技術のまま。この欠点は、顕微鏡検査分野における大きな問題の一部であり、Ryanは総所有コストとして識別します。

イメージングシステムは、高性能のコンピュータ能力、生成された大量のイメージングデータを転送して格納するために必要なケーブル、コンピュータカード、およびその他のデバイスも含む総コストの一部に過ぎない。高速ライブセルダイナミックイメージングの生のスピードと解像度はsCMOSで達成することができます。目標は現在、この技術をより広く利用できるようにすることです。

RyanはQImagingはそのRolera™ Bolt、第一世代sCMOSカメラと多少異なるアプローチを取ったと説明しています。30フレーム/秒の速度で動作し、それは高速CCDカメラよりもありましたまた、全生物における生細胞イメージングと運動性の研究のために設計されていますが、より高速sCMOSカメラのコストのほんの一部で利用可能としました。

ラベリング技術は顕微鏡検査の進歩に追いつくために競争している、とJoubertは述べる。STORM(例えば、タンパク質標的を画像化するために免疫標識を用いる超解像技術)では、標識された抗体は、数ナノメートルのオーダーであり、これはイメージング解像度とほぼ同じである。Riesら 今年初めに、有機色素と結合したナノボディと呼ばれる小さな抗体を用いたGFPベースの超解像顕微鏡検査(Nature Methods)の方法を発表した。 これは、標識剤のサイズおよびより大きな抗体に利用できない構造にアクセスする能力のため、最小限の標識変化でナノメートルの空間分解能を達成した。

技術の融合

超解像度などの新しい技術では、「封筒の端を押しているので、新しい発見が実際であることを確認するために複数のテクニックを使用する必要があります」とJoubert氏は言います。「例えば、超解像顕微鏡法を用いて2つの分子が相互作用しているかどうかを確認するには、相互作用していることを確認するためにFRETのような補足的な技術が必要です。」

WITecのマーケティング・ディレクター、Harald Fischerは、あるシステムでさまざまな顕微鏡技術を統合するための機器メーカー間の新たな傾向をエコーします。WITecは、例えば、高速共焦点ラマン顕微鏡を提供し、ラマン原子間力顕微鏡の楽器を統合しました。共焦点ラマン顕微鏡の新世代は、「通常の3D化学イメージング」を可能にする。 その前は、真の共焦点画像ではなく、ポイント・バイ・ポイントのマッピングでした」とFischer氏は指摘しています。

同社のTrueSurface Microscopy Modeはalpha300顕微鏡シリーズで利用可能なオプションで、大きなサンプルでトポグラフィラマンイメージングが可能です。「測定モードの機能的なコアは、光学プロフィロメトリーのセンサーです。これは現在、顕微鏡の対物レンズのターレットに固定されています」とFisher氏は述べています。「このシステムは、大きな試料の表面トポグラフィを測定し、それを広範囲の試料調製の必要なしに共焦点ラマン顕微鏡法と相関させる。」

顕微鏡技術の3つの主な傾向を説明するように頼まれたとき、McMillanは2つの繰り返しテーマに「使いやすさと自動化の容易さ」を追加しました(高解像度で大量の組織を撮像し、生きた細胞および生物の画像化)。この傾向は技術と製品の境界線を横断し、顕微鏡システムをより使いやすいものにします。

McMillanによって表現された目標は、他のメーカーのデバイスを含む複数の異なるテクノロジプラットフォームを制御するために使用できる統一されたユーザーインターフェイスを設計および開発することです。

アドバンスド・マイクロスコープ・グループのマーケティング・プロジェクトマネージャー、ニキ・ボルマン(Niki Volkmann)は、業界最高のトレンドとして「使いやすさ」を評価しましたこれが続いている「緑の技術と価格性能比。」Volkmann氏によると、同社のEvos®ワークステーションはこれらのトレンドを実証しています。特に、Evosファミリの最新バージョンであるFL Autoは、タッチスクリーン技術とウィザードベースのソフトウェアを備えた自動化されたシステムです。

細胞培養用途のために設計され、AMGのXL Core顕微鏡は、位相コントラストや明視野光学系を搭載しています。

特定用途向けの標準複合型顕微鏡の機能を強化するアドオンモジュールやデバイスの代わりに、企業は低レベルの学習曲線を持つ使いやすいシステムになるように設計された専用機器を開発しています。

顕微鏡の詳細については、GENのエキスパートヒント「正しい顕微鏡検査システムを選択するための4つのヒント」を必ずチェックしてください。

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24 tiled areas composed of nearly 9,000 images stitched together using FluoView stage control and stitching software: 4 mm scaleview objective. [Olympus America]A two-day-old zebrafish labeled with H2A-mCherry (red) and autofluorescence (green). [Carl Zeiss]

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