技術的特徴 - 顕微鏡検査：OpenSPIM 2.0

フランクフルトのBrain ResearchのMax Planck Institute（MPI）のイメージング施設の物理学者でプログラマーであるFlorian Vollrathは、短いコースを経て、イメージング施設に同僚との薄いシート顕微鏡を構築する用意があると語った。彼らは、クリアされた脳サンプルを10cm³ほどの大きさでイメージしたいと考えています。光シート顕微鏡では、研究者は光のスライスを使用してサンプルを分割することができます。利用可能な商業用機器だけでなく、自分で構築できるモデルもあります。

「私は光シートシステム用のオープンソース・コミュニティを持つというアイデアが好き、」Vollrath氏は述べています。彼はオープンハードウェアとソフトウェアの動きの一部であり、オープンアクセスの選択的平面照明顕微鏡（OpenSPIM）に専念するウェブサイト上で提供される情報を使用する¹。

Maximilian Telfordの研究室のUniversity College Londonの生物学博士課程の学生であるJohannes Girstmairは、OpenSPIM機器をゼロから構築し、以前の経験なしに構築しました²。彼は進化的発達生物学の質問に焦点を当てるためにそれを使用しています。例えば、彼は扁形動物Maritigrella crozieriのスパイラル切断パターンとその自由水泳planktotophic幼虫期を研究しています。Girstmairは、ドレスデンにある分子細胞生物学と遺伝学のマックスプランク研究所（MPI）のPavel Tomancakの研究室を訪れたときにOpenSPIMを最初に試しました。Girstmairと彼の同僚は、緑色蛍光タンパク質タグ付き核および膜を画像化しました。彼らはまた、画像化が困難なMaritigrella胚および幼虫の詳細な3D再構成を生成した。「その時点で、OpenSPIMの可能性を実際に見ることができました」とGirstmair氏は言います。

Johanna Gasslerは、ウィーンの分子生物学研究所の博士課程の学生であり、橘幸子 - コンヴァルスキ研究室に所属しています。彼女はまだ彼女自身の顕微鏡を内蔵していないが、彼女は彼らがしたことに満足しているいくつかの生物学者を知っています。独自の顕微鏡を構築することは、あなたがサンプルや実験のために何が必要かを考えるようにし、それらのニーズにすべてを調整することができます、と彼女は言います。

幅広いOpenSPIM機器が構築されています：eduSPIMは、ドレスデンの科学博物館訪問者に顕微鏡検査を教えるために使用される略式モデルです³。他のモデルは複雑で、基本的な設定にほとんど似ていないとTomancak氏は述べています。他のバージョンでは適応されています。これの一例はGirstmairのT-openSPIMで、両面照明（より典型的な片面照明とは対照的に）を有する光シートを形成する。

彼のMPIの同僚とランチを食べながらTomancakは、2010年にOpenSPIMを開始しました。彼はできるだけ多くの生物学者の手に楽器を得るために、部品リストや組み立て動画などのオンラインリソースを、設定します。ラボラトリーズは、光シートシステムがまだ市販されていないときに、独自のセットアップを構築し始めました。それは活動の増加につながった。これは、実験室が光学テーブルの問題をトラブルシューティングするのを助け、生物学者が実験をするのを助けるために、Tomancakと他の人たちに動機付けました。OpenSPIM 2.0が今迫っている、Tomancak氏は述べています。

資金調達が成功すれば、OpenSPIM 2.0はイメージをより速くキャプチャし、研究室が多くのタイプの顕微鏡を組み立てることを可能にするモジュラーシステムになるとTomancakは言う。1つの研究室では、オプトジェネティックス実験のための特定の構成が必要な場合があります。いくつかのラボでは、毎秒10枚のイメージスタックをキャプチャする必要があります。あるいは、他のものは高いイメージングスピードを必要とせず、貴重なサンプルを5日間連続してイメージングすることを可能にする安定性を優先させる。Tomancak自身は、何千もの遺伝子の遺伝子発現パターンを画像化するために、高いスループットを持つOpenSPIMシステムを構築したいと考えています。OpenSPIM 2.0は、コスト効率、コミュニティへのコミットメント、オープンアクセスの原則を維持しつつ、これらの異なるニーズに対応すると同氏は述べています。新しいシステムが開発中であるので、ユーザーエクスペリエンスの株式を取るのに良い時期です。

SPIMの優位性

観察された単一焦点面のみを選択的に照明することにより、生体内で撮像された大きなサンプルまたは生物に対する光損傷が低減される。SPIMの発明者および開発者Ernst Stelzerおよび欧州分子生物学研究所（EMBL）の彼の同僚は、2004年にこの方法を生物学に応用したときのいくつかの利点の1つとしてこれを強調し⁴。実験者は、複数の角度からサンプル（例えば、不透明なショウジョウバエ胚など）を注視し、事象が進行するのを見て、3D遺伝子およびタンパク質発現パターンを捕捉することができる。

彼のOpenSPIM画像は、共焦点顕微鏡で得られるものほど鮮明ではなく、高解像度でもない、とGirstmair氏は述べています。しかし、標本を共焦点顕微鏡に載せる方法を考えると、複数の角度から簡単に画像を取得することはできません。そして、不透明で卵黄で満たされた難しい標本では、「月を3D再構成するようなものです」と彼は言います。「暗い面」を見るために、実験者はサンプルを回転させて画像を再キャプチャする必要があります。共焦点イメージングを用いて発達中の胚を観察することは、発達中に胚を完全なレーザービームにさらすことを意味する。Maritigrellaの最初の切断は最大2時間かかることができます。彼が明らかにしたように、彼はOpenSPIMのセットアップが胚全体ではなく単一の平面を照らしていることに感謝しています。また、高速であり、共焦点顕微鏡よりも短い時間枠内でより多くの画像を取得します。Girstmairは、ポリクラドフラットワームを見るとき、光毒性を過小評価してはならないため、このことは重要だと言います。

Karolinska InstituteのPhD学生であるTiago Pinheiro氏は、固定サンプルで光シート顕微鏡法を使用することで、より効率的に時間制限内で作業したいと考えています。彼は、ドーパミンニューロンの再生を研究するために、空白のサンショウウオの脳に取り組んでいます。この動物の脳は、マウスの脳より約25倍小さい。しかし、単に画像サンショウウオの嗅球に彼は8〜12時間の共焦点顕微鏡でサンプルを残していました。神経突起を研究することは、より長い時間を要し、試料を漂白したであろう。

Pinheiroは、光シート顕微鏡で進行につれて、彼はそれが彼がボリューム全体を見てみましょうことを気に入っています。また、彼は細胞と繊維が互いにどのように関係しているかについての視点を得ることができるので、多くの定量的パラメータを抽出することができます。OpenSPIMでは、彼は彼が働く規模を増やしたいと考えています。各時点および各動物群について少なくとも3回の反復（2つの時点、対照群および病変群を有する小規模な実験でさえ）からのデータの収集は、12頭の脳を画像化することを意味する。光シート顕微鏡は高速ですが、研究室の商用システムが大量に使用されているため、必要とする撮像時間を予約することはできません。OpenSPIMでは、科学者が科学的な質問を光シート顕微鏡で進めることができるかどうかを知ることができます。もしそうなら、1つまたはいくつかのそのような顕微鏡を構築することにより、画像取得をスピードアップすることができるとPinheiroは述べています。OpenSPIM機器はまた、視覚的な先生です。「「裸の」顕微鏡を見ることで、光シート技術がどのように機能するかについて非常に深い理解を得ました」と彼は言いました。これは、商用システムで行うことはできません。

彼はStelzer紙を見た後、その後、カリフォルニア大学バークレー校のジェラルド・ルービンのラボでポスドクだったTomancakは、彼のPIのオフィスに行ってきました。彼は、「これは未来であり、私たちはそれを使わなければならない」と彼が言ったことを思い出している。当時、Rubinは納得していないし、Tomancak氏は述べています。しかし、2人の男性の間での最近の会話の中で、今JaneliaファームリサーチキャンパスのディレクターであるRubinは、彼の興奮は正当だったことTomancakに語りました。Tomancakは今OpenSPIMと光シート顕微鏡について、毎年、欧州分子生物学機構（EMBO）のコースを整理するのに役立ちます。

初期のOpenSPIMユーザーは光学技術開発者だったとTomancak氏は述べています。しかし、発達生物学者は、OpenSPIMが開発システム全体を見て、可能な限りすべての細胞をモニターし、形態形成を調べることを可能にすることをすぐに認識しました。神経生物学、生理学、組織培養および細胞生物学の研究者が興味を持ち始めているし、次のかもしれない、と彼は言います。

Nature Methodsと話し、同定されることを望まない発達生物学者の一人は、彼が初期のOpenSPIMモデルでしか働いていないと言いました。「自家製のモデルで見たものから、彼らは敏感である傾向があり、通常はビルダーだけが操作することができます」と彼は言います。このシステムは一般的な用途には適しておらず、ユーザーフレンドリーではありませんでした。「しかし、今は状況が改善されている可能性があります、」と彼は言います。

カリフォルニア工科大学の発達生物学者Marianne Bronnerは、商業用および自家製のSPIMの両方を使用しています。彼女は両方のバージョンでメリットを見ます。市販のライトシート顕微鏡は、彼女の目的のためにうまく機能します。彼女はまた、「私は、家庭で作られたカスタムモデルが、単一の使用を念頭に置いて設計されているため、特定の目的に対してより良い解決策になる可能性が高いと考え。」

Bronnerは、Caltechの生物イメージング施設のディレクターAndres Collazoと定期的に仕事をしています。この施設には、2つの市販の光シートシステムがあります。彼が教えるクラスの一環として、彼と4人の学生がOpenSPIM機器を作りました。彼らが得た「私からほんの少しの助けを、」Collazo氏は述べています。OpenSPIMシステムは非常に優れていますが、カラーレーザーは1つしかないため、特定のアプリケーションにのみ適しています、」と彼は言います。ライトシートはシリンドリカルレンズを使用して作成されます。彼の見解では、このタイプのレンズはレーザーを走査するほど良くはなく、より明るい照明を提供する光シートを作り出します。しかし、スキャナーを構築すると、カメラを除いて約18,000ドルかかるシステム上の価格タグが上がる。商用システムはより強力で柔軟性がありますが、システムによっては$ 200,000〜$ 500,000のコストがかかります。「すべてのことを考えると、私はOpenSPIMのファンであり、非常に特定のアプリケーションでは非常に便利だと思っています、」と彼は言います。CollazoのOpenSPIMはOpenSPIM 1.0に基づいていました。彼は、「私は彼らが2.0でやることに興味がある」と言います。

ソフトウェアベースの質問に関連する彼のOpenSPIMシステムのトラブルシューティングの一部。Collazoはまた、「我々は、カメラ焦点面を試料焦点面と整列させることは決して決してできません」と述べています。「それはオフに少しだけでしたが、あなたは見ることができました。」彼はCaltech化学部門のマシンショップと共同で仕事をしていました。そこに、同僚は、彼がOpenSPIMのウェブサイトによると必要な部品を作り、また、それらを再調整しました。OpenSPIMのセットアップは、接眼レンズを持っていません。Collazoは、それがこれに調整するためにいくつかの時間を取ることができることを述べているが、彼はカメラを通して標本を見に使用されています。「最悪の事態の1つは、ソフトウェアがイメージがライブイメージであることが示されているが実際にはロックされていることです」と彼は言います。「それが起こるとき、あなたはすぐにアライメントを台無しにすることができます。」

OpenSPIMを構築することは楽しかった、すべてのピースを集めてレイアウトされた後、Girstmair氏は述べています。取得チェンバーや軸ホルダーなどの部品の一部を機械加工する必要があると彼は言います。彼は、それはあなたが特定のシステムに最適な部品を注文することができるようにカタログを持っているのに役立つだろうと述べています。「あなたは、少なくとも初めに、レーザーを整列するために起動したときの楽しみは通常終了し、」と彼は言います。しかし、ミラーを動かすことやビームスプリッタを正しい場所に配置することに慣れてきたので、それはより簡単になりました。

Tomancakはラボが自分の光シートを整列させるのに助けを必要とするかもしれないことを認めています。彼らはまた、光シートの厚さを含め、彼らのシステムを知っている必要があります。別の研究室で構築された二つのOpenSPIMsは、アライメントや光学機器の意思決定が原因である可能性が異なる厚さの光シートを、持つことができる、と彼は言います。このようなパラメータは商用システムでも重要である。「ライトシートはシートと呼ばれますが、シートではありません。基本的に、それは砂時計のようだ：それは真ん中に薄いですし、徐々に厚くなる、」と彼は言います。この側面は標本の配置に重要です。

フランクフルトのゲーテ大学でStelzerの研究室では、生物学者は頻繁に彼の商業LSFMに加えて、彼の5つの自家製光シートベースの蛍光顕微鏡（LSFMs）を使用します。彼らは、標本が最適な角度に沿ってうまく配置され、観察されることを確認します。そして、彼らは、これらのシステムを揃える時間を費やす必要はありません。「それは確かに光シート顕微鏡を構築するための素晴らしい経験ですが、私は常に、従来の蛍光顕微鏡で開始することをお勧めします」と彼は言います。次に、自家製と商用システム間のパフォーマンスを比較します。

家庭で作られたSPIM計測器では、安定性が大きな問題です、Stelzer氏は述べています。彼の研究室では、ユーザーは単一の楽器ネジに触れません。標本が動かない限り、数日間撮像のために焦点が合わされ、システムは安定したままである。安定性を念頭に置いて、彼は単一のアルミニウムブロックから製作されたモノリシックでデジタルスキャンされた光シート顕微鏡を持っていました⁵。光学システムでの彼の経験では、ミラーもレンズも、最適な性能を提供するために「多くの自由度」を必要としません。回折限界の顕微鏡では、科学者はすべてをマイクロメートルレベルの精度で計算することができます。「計算と測定値の間の任意の大きな偏差があなたがミスを犯してきた示し、」と彼は言います。

Stelzer氏は、ライトシート顕微鏡での2つの照明と検出の光路は、さまざまなやり方で、最終的にはより良いものになると考えられます。任意の視野問題に対処することができます。例えば、視野を本質的に満たす回転楕円体を撮像するには、研究者はかなり広い、さらには軸方向の分解能が必要です。植物の主根（カメラの視野の中心に細長い長い物体）を結像するとき、照明軸に沿った小さな視野で十分である。そして、科学者は2倍または4倍で光シートのサイズを小さくすることができます。「私は悪いイメージと悪いサンプル調製がLSFMに悪い評判を与えていることを心配しています」と彼は言います。

組立を通して学ぶ

Jeff Carmichaelは、光学フィルターを製造するChroma Technologyのテクニカルプロダクトマネージャーです。一般的に、彼はOpenSPIMのアイディアが好きで、OpenSPIM 1.0を基本的な構成と呼んでいます。彼の意見では、パーツリストから欠落している一つの項目は、レーザー「クリーンアップ」フィルタです。これは、指定された波長を超えてレーザー排出をクリーンアップする狭帯域パスを持つ励起フィルターです。クリーンアップが必要なナノメートル（nm）の発光範囲を持つレーザーダイオードのファミリがあります：およそ405nm、440nmおよび640nmの範囲のもの。

発光フィルタまたは二色性物質を妨害する光の入射角のために問題が発生する可能性があります。干渉フィルタを使用すると、「ブルーシフト」が発生する可能性があります。これは、コーティング層のフィルターの薄膜スタックを通過する際に、「高い」入射角での光が挙動する方法が原因であると、カーマイケル氏は述べています。例えば、520nm〜550nmの帯域通過を有するフィルタは、517〜549nmの波長を有するフィルタのように振る舞い得る。10度は問題になりうるし、 「20度はキラーになるかもしれない、」と彼は言う。これは実際の蛍光シグナルに影響を与えないかもしれない。しかし、エミッションフィルターが励起を効果的に遮断しなくなると、画像にノイズが発生します。より大きな入射角を予期して干渉フィルタを設計する方法がある。既製フィルタが働くことができる、と彼は言うが、彼の会社と他の人は、特にこの問題に対処するフィルタを作ることができます。

ThorLabsで画像システムとライフサイエンスの活動を管理しているSam Rubinは、OpenSPIMのような開発を見てうれしいです。光ブレッドボードとレールから誘電体ミラーへのマウントまで、OpenSPIM推奨パーツリストの多くのコンポーネントはThorLabs製品です。同社は、特定の寸法の部品が必要になる場合がありますラボをアドバイス世界中に約100の技術サポートエンジニアを持っています。問題のデバッグを支援するために、同社のエンジニアは、顧客のセットアップの一部を再作成することができます。

同社は、ライフサイエンスおよび物理学コミュニティが使用する約2万種類のコンポーネントを提供しています。毎年、2,000〜3,000のコンポーネントが追加されており、その多くは「顧客から影響を受けている」とRubin氏は述べています。たとえば、OpenSPIMの研究者がミラーマウントを変更した可能性があります。これは、会社が新製品に組み込む変更である可能性があります。そのような製品の1つは顕微鏡対物レンズアダプタであり、これは顧客が「エキゾチック」な対物レンズのためのアダプタを探し求めた結果生じたものです、と彼は言います。客観的なサイズは大きく異なります。長い作動距離を持つものは、スレッドの多くの種類があります。ThorLabsは、科学者にこの部分を開発してもらうように請求するのではなく、この研究者とそれを購入したい他の人のためにアダプターを製作しました。

近年、ThorLabsはマルチフォトン顕微鏡などの完全なイメージングシステムの販売を開始しました。同社は、まだ光学シート顕微鏡用のシステムやモジュールを提供していませんが、OpenSPIMコミュニティが必要とするようなコンポーネントを提供しています。すべての彼らのイメージングシステムは、オープンハードウェア機器です。「私たちは、顧客がシステムをハックしてシステムを改善することをほぼ奨励しています」とRubin氏は言います。彼らはハッキングされたシステムの写真を投稿し、多くのハッキングをシステムに統合します。同社はまた、コンポーネントから独自にビルドすることを望まないラボ用に、アライメントされ較正された光学システムなどのモジュールも販売しています。

Rubinが説明するように、ThorLabsはOpenSPIMコミュニティなどの情報共有の動きの影響を受けます。企業のエンジニアチームは、大勢の開発者より優れているわけではありません。ThorLabsはハードウェアの青写真を共有し、オープンソースソフトウェアを使ってイメージングシステムを提供しています。「ある意味では、それはOpenSPIMの本の中にあるページだと思う」と彼は言う。

進行を育てます

TommcakはOpenSPIMコミュニティが現在直面している主要なハードルはソフトウェアの問題であることを認めています。コンピューティングとプログラミングの知識がなければ、他の人の助けを必要とするかもしれません。資金援助が増えれば、ユーザーに対するサポートが増えるだろう、と彼は言う。

OpenSPIM 1.0を構築した後、彼の資金調達水準は低下しましたが、Tomancakは最近、フィジーのソフトウェアパッケージを進めるための資金提供を受けました⁶。顕微鏡は、複数の角度でサンプル画像をキャプチャしているので、OpenSPIMの画像は、登録された融合し、デコンボリューションおよび使用可能なデータを作成するためにダウンサンプリングする必要がある、と彼は言い。フィジーは、その目的のために彼の研究室で開発されたオープンソースのソフトウェアパッケージです。開発者の中には自社の研究所に移っているものもあります。しかし、ソフトウェアを改善し、他の人にそれを使う方法を教えるために、ウィスコンシン大学の光学計算機研究所のTomancakらは、オリジナルの開発者と新しい研究者を結集させるための「Hackathons」を組織。

研究者はまた、カリフォルニア大学サンフランシスコ校Ron Valeの研究室で開発され、現在Open Imagingと呼ばれる会社によって維持されているμManagerへのインタフェースを構築しました。フィジーのμManagerへのOpenSPIMインターフェイスは、ユーザがOpenSPIM機器でキャプチャした画像を解析できるようにします。彼らはライカやツァイスのような商業用機器からのデータを処理し分析することができます、とTomancakは言います。

GirstmairはOpenSPIMソフトウェアが彼のために働いていると言い、μManagerにも満足しています。「しかし、もし特定のSPIMプラグインを改良して、より堅牢で安定したOpenSPIMソフトウェアを作成する人がいれば素晴らしいだろう。

OpenSPIMのツールを構築することは、あなた自身のためにすばらしいツールを用意することを意味するだけではありません、とGirstmairは言います。それは通常あなたの周りの他の多くの研究者の関心を引き付けるものです。それは新しいコラボレーションを構成するのに役立ちますが、他の人のプロジェクトに多くの時間を費やす危険もあります。「OpenSPIMは完璧ではないかもしれないし、市販の顕微鏡と同じくらい簡単に使うこともできないかもしれないが、画質の点で何ができるのかは、何度も何度も驚いている。

全体として、OpenSPIMの動きは「私たちに依存していません」と、Tomancak氏は言います。彼は、ソフトウェアとハードウェアを進歩させ、OpenSPIMコミュニティをサポートするよう求めています。OpenSPIM 2.0をお楽しみに。

Stelzerの見解では、研究者はまだLSFMが何を行うことができるのかを十分に活用していない。「デザインのシンプルさは、私たちは、すべての人間工学的な問題を無視し、非常に基本的な楽器を構築することができます。代わりに、我々は単に準備を最適化し、光源とセンサーの性能を最大限に活用することで、試料および生物学的問題に集中できる」と彼は言います。一方、彼は、（蛍光相関分光法などの）強度変動の時空間分析および励起光の高速変調および（蛍光寿命イメージングにおけるような）放出光の高速位相シフト観察を制御することは、ライトシート蛍光顕微鏡法の標準となるでしょう。それはLSFMを生化学実験室に変えてくれると彼は言います。

Vivien MarxはNature Methods（v.marx@us.nature.com）の技術編集者です。

参考文献

1. Pitrone、P.G. ら。「ネイチャー・メソッド」 10、599〜600（2013）。
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2. Girstmair、J. ら。「BMC発生生物学」16、22（2016）。
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3. Jahr、W. 、Schmid、B. 、Weber, M. ＆ Huisken, J. 「PLOSワン」11、e0161402（2016）。
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4. Huisken, J. 、Swoger, J. 、Del Bene, F. 、Wittbrodt, J. ＆ Stelzer, E.H. 「科学」305、1007〜1009（2004）。
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5. Keller、P.J. ＆ Stelzer、E.H. 「コールド・スプリング・ハーバー・プロトコル」5、 pdb.top78（2010）。
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6. Schindelin、J. ら。「ネイチャー・メソッド」9、676〜682（2012）。
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